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內參GAPDH有兩條帶能用嗎（內參兩個條帶）

發(fā)布時間：2023-04-13 20:15:41 稿源：創(chuàng)意嶺閱讀： 50

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本文目錄:

1、做定量pcr時內參GAPDH變化了，是不是要換個內參?
2、哪位知道GAPDH內參有什么優(yōu)點？
3、內參配制方法
4、gapdh什么情況下不用做內參

內參GAPDH有兩條帶能用嗎（內參兩個條帶）

一、做定量pcr時內參GAPDH變化了，是不是要換個內參?

可以換一個。其實很多藥物影響糖代謝，會改變GAPDH。建議試試PPIA（肽基脯氨酸異構酶），它與蛋白質表達有關，含量比較穩(wěn)定，除靜息細胞外基本不變。

二、哪位知道GAPDH內參有什么優(yōu)點？

◆Real－time PCR技術的原理就是用一種標準對照能夠估計出一種特異性靶DNA或RNA分子的相對含量。

◆這種標準對照就是參照物，在定量PCR中，用它來作為擴增系統(tǒng)的陽性對照，并作為未知樣品定量的標準，同時通過競爭性作用校正擴增系統(tǒng)內管間的擴增效率，使其具有可比性。參照物按其性質不同可分為內參照和外參照。內參照是與目的基因加于同一反應管中，與目的基因同時進行擴增，以反映體系中可能出現(xiàn)的PCR影響因素，此即所謂的競爭性PCR；而外參照則是參照物與目的基因的擴增分別在不同的管間進行，此即所謂的非競爭性PCR。

◆搞清了內參和外參的概念，你的問題也就很容易解答了：由于你實驗中GAPDH和目的基因反應體系是在不同的EP管中進行，所以它應屬于外參照。

三、內參配制方法

內參配制方法：WB操作簡單，既可以定性分析表達產物，同時還可以指示目的蛋白量的相對變化。作為一種有活性的生物大分子，抗體和抗原的反應是比較復雜的，因此用來測定表達產物時存在著一定的不確定性。所以，在WB實驗設計中加入良好的參照體系，對實驗結果分析是非常有幫助的。參照體系通常包括分子量Marker（用來確定蛋白條帶對應的分子量大?。瞻纵d體對照（如果是誘導表達體系還應該有誘導前的對照），已知量標準產物的正對照，此外還有內參。

內參是zui容易被忽略的一項，如果要用WB比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達量的相對多少，等量的細胞上樣才有比較的基礎。特別表達量不高時，上樣量的差別就很可能影響結果的分析，所以此時內參就顯得尤為重要。

內參即是內部參照（Internal Control），對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白（Housekeeping Proteins），它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。在WB實驗中，除了需要進行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進行內參的檢測，以校正蛋白質定量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結果的準確性。

蛋白濃度測定是比較各種樣品間上樣量的*方法。然而各種蛋白質濃度定量方法都存在局限性，不能*準確的確定各種樣品的準確蛋白濃度。如UV法直接定量，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質，相對于比色法來說，操作簡單，但是容易受到平行物質的干擾，如DNA的干擾；且敏感度低，要求蛋白的濃度較高。比色法測定蛋白濃度一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。BCA法與Lowry法都容易受到蛋白質之間以及去污劑的干擾。Bradford 法敏感度zui高，且與一系列干擾Lowry，BCA 反應的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的，其zui主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結果差異較大，無可比性。另外，蛋白質定量以后進行電泳時需要等量上樣，此步驟也存在操作誤差。在WB實驗時使用內參，即可簡便地對定量和上樣步驟產生的誤差進行校正。

在WB中使用內參其實就是在WB過程中的另外用內參對應的抗體檢測內參，這樣在檢測目的產物的同時可以檢測內參的表達，由于內參在各組織和細胞中的表達相對恒定，借助檢測每個樣品內參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結果才更為可信。此外使用內參可以作為空白對照，檢測蛋白轉膜情況是否*、整個WB顯色或者發(fā)光體系是否正常。

實驗結果分析其實很簡單：如果樣品蛋白量有限，只夠進行一次電泳轉膜實驗時，分別檢測樣品的內參量和目的蛋白量。將各樣品目的蛋白量分別除以其內參含量，得到的數(shù)值即為內參校正后的各樣品中目的蛋白相對含量，再用此數(shù)值進行樣品間的比較和分析，得到目的蛋白含量在不同樣品間的實際變化結果。如果樣品量充分，可以先檢測內參，觀測樣品間內參顯色條帶是否一致，根據(jù)差異大小調整各樣品的上樣量重新進行Western Blotting實驗，至內參量一致為止；若內參一致，即可進行不同樣品間目的蛋白表達變化分析。常用的蛋白質內參有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和細胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。

四、gapdh什么情況下不用做內參

不恒定。GAPDH的基因表達量在是不同狀態(tài)下是變化很小的，所以可以認為GAPDH表達是恒定的，能夠可以選擇它來做內參，只有不恒定的情況下才不會選擇做，這樣會導致GAPDH的表達量會增多。

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